데스몬드 마일스는 바텐더로 일하다가 아브스터고 인더스트리에게 납치되어 "아니무스"라는 유전 기억을 시뮬레이션할 수 있는 장치의 실험 대상이 됩니다. 아브스터고는 데스몬드를 장치에 넣어 1191년 성지에서 제3차 십자군 전쟁 중 암살자 형제단의 일원인 그의 조상 알타이르 이븐 라 아하드의 기억을 되살리려 합니다. 처음에 데스몬드는 장치에 적응하는 데 어려움을 겪지만, 결국 며칠 동안 알타이르의 업적을 되살리게 됩니다. 이후 게임은 주로 알타이르의 시점으로 진행되며, 아니무스의 문제나 블리딩 이펙트의 발현으로 인해 가끔 데스몬드의 시점으로 전환됩니다.
게임은 데스몬드가 알타이르의 기억에 들어가는 것으로 시작되지만, 그는 곧 동기화 문제에 직면합니다. 이때 루시 스틸먼과 워렌 비딕의 목소리가 들리며 데스몬드의 안전에 대해 논쟁합니다. 몇 가지 문제를 겪은 후, 데스몬드는 가상 기계에서 나와 비딕에게 아니무스의 내부 작동에 대해 설명을 듣고, 기계의 튜토리얼 프로그램을 시작합니다. 데스몬드가 튜토리얼을 마친 후, 그는 알타이르의 가장 가까운 동기화 가능한 기억에 들어가고, 루시는 데스몬드가 알타이르의 삶의 주요 순간들을 되살려 동기화를 높여야 한다고 덧붙입니다. 마지막 기억에 도달하면 아브스터고가 찾고 있는 정보가 담겨 있습니다.
알타이르는 처음에 말릭 알-사이프와 그의 형 카다르의 도움을 받아 솔로몬의 성전에서 "에덴의 조각"이라 불리는 일련의 유물 중 하나를 회수하려고 시도하지만, 그들은 암살자들의 sworn enemy인 템플 기사단의 대사제 로버트 드 사블레에게 저지당합니다. 보물을 회수하는 과정에서 알타이르는 로버트를 죽이려 하다가 암살자 신조의 세 가지 원칙을 모두 어기지만 결국 실패합니다. 그 후의 소란 속에서 말릭의 형이 죽고, 말릭의 왼팔은 불구가 되어 나중에 절단됩니다. 알타이르는 사과를 하며 마시아프의 암살자 요새로 돌아오지만, 드 사블레를 살아남은 말릭은 유물을 가지고 돌아와 알타이르의 오만함을 비난합니다.
템플 기사단의 보복 공격을 간신히 물리친 후, 암살자들의 리더 알 무알림은 알타이르를 초급자로 강등하지만 형제단의 계급을 다시 오를 기회를 줍니다. 알 무알림은 알타이르에게 예루살렘, 아크레, 다마스쿠스에 있는 9명의 주요 인물을 암살하는 임무를 부여하며, 십자군과 사라센 세력 간의 평화를 이루려 합니다. 각 목표는 제3차 십자군 전쟁의 실제 역사적 인물인 마즈드 아딘, 가르니에 드 나플루스, 주바이르 알 하킴, 아부 알 누쿳, 시브란드, 몽페라의 윌리엄, 로버트 드 사블레 등을 기반으로 합니다.
알타이르는 각 임무를 완수하며 각 목표가 로버트와 템플 기사단과 어떻게 연결되어 있는지, 그들이 어떻게 함께 십자군 전쟁을 끝내고 성지를 자신들의 통제 하에 두려 하는지를 알게 됩니다. 양측의 사람들이 죽어가면서 그는 로버트의 마지막 음모가 기독교와 이슬람 세력을 새로운 공통의 적인 암살자들에 맞서 단결시키려는 것임을 발견합니다. 알타이르는 리처드 1세 앞에서 드 사블레를 물리치지만, 전쟁의 종식이 양측에 환영받을 것이라고 왕을 설득하는 데 실패하고 로버트의 음모를 끝냅니다. 드 사블레에게서 알타이르는 알 무알림이 템플 기사단의 일원이며, 유물을 지키고 있는 다른 구성원들을 죽이기 위해 암살자를 이용했음을 알게 됩니다. 그렇게 그는 유물을 이기적으로 자신만의 것으로 만들기 위해서입니다.
알타이르는 신속히 마시아프에 돌아와 그의 스승에게 접근하고, 스승은 그에게 진실을 밝혀줍니다: 그가 알타이르의 도움으로 회수한 에덴의 조각은 환상을 만들어냅니다. 그는 종교와 이집트의 열 가지 재앙, 홍해의 분리, 트로이 전쟁의 그리스 신들의 존재와 같은 초자연적인 사건들을 에덴의 조각이 만든 환상으로 비난하며, 인류를 세뇌 상태로 강제하기 위해 이 유물을 사용하겠다는 의도를 밝힙니다. 그렇게 모든 갈등을 종식시키겠다는 것입니다. 결국 알타이르는 유물이 만들어낸 속임수를 간파하고 알 무알림을 죽입니다. 알타이르가 유물을 회수하자 에덴의 조각이 활성화되어 세계의 홀로그램 뷰를 보여주며, 전 세계에 다른 에덴의 조각들이 표시됩니다.
과정이 완료되자 데스몬드는 아브스터고가 현대의 템플 기사단의 전선이라는 것을 알게 되고, 그들이 이미 알타이르의 기억에서 확인된 장소에서 다른 유물을 찾고 있다는 사실을 알게 됩니다. 또한 현대의 암살자들이 기억이 완료되기 전에 그를 구출하려 했지만 실패했다는 것도 알게 됩니다. 그 후, 데스몬드는 고위 템플 기사단원인 앨런 리킨의 명령으로 죽임을 당할 위기에 처하지만, 루시 스틸먼이 그를 구해주고, 한때 그녀의 약지 손가락을 손바닥에 집어넣으며 암살자들의 전통인 손가락 절단을 언급합니다.
비록 데스몬드는 아브스터고 실험실에 갇혀 있지만, 아니무스에서의 경험은 알타이르의 삶의 블리딩 이펙트를 만들어내어 데스몬드가 알타이르의 이글 비전을 사용할 수 있게 합니다. 이는 그가 자신의 방 벽과 실험실 바닥에 그려진 이상한 메시지를 볼 수 있게 해줍니다. 메시지는 모두 다양한 문화에서의 세계 종말에 대한 형태를 다루고 있으며, 아브스터고가 "전쟁을 영구적으로 끝낼" 위성을 발사할 계획인 2012년 12월 21일에 대한 여러 언급이 포함되어 있습니다. 이 방법이 알 무알림이 마시아프를 최면에 걸리게 한 방법과 유사할 것이라는 암시가 있습니다. 마지막으로 게임은 데스몬드가 이 이미지들이 의미하는 바와 누가 그것들을 그렸는지 궁금해하며 끝납니다.
Desmond Miles, a bartender, is kidnapped by the company Abstergo Industries for use as a test subject in the "Animus," a device that can simulate genetic memory. Abstergo intends to put Desmond in the device to recall the memories of his ancestor, Altaïr Ibn-La'Ahad, a member of the Assassin Brotherhood in the year 1191, who lived during the Third Crusade in the Holy Land. Initially, Desmond has trouble adjusting to the device, but eventually relives Altaïr's exploits over the next several days. The game then primarily changes to Altaïr's point-of-view, with occasional transitions to Desmond, due to problems with the Animus or onset of the Bleeding Effect.
The game opens with Desmond entering Altaïr's memory, but he soon faces synchronization problems. On this, Lucy Stillman and Warren Vidic's voices can be heard, arguing over Desmond's safety within the Animus. After experiencing a few problems, Desmond exits the virtual machine and Vidic briefs him about the Animus' inner workings, before initializing the machine's tutorial program. After Desmond is done with the tutorial, he enters the closest synchronizable memory of Altaïr; Lucy adds that Desmond has to relive key moments of Altaïr's life to increase his synchronization, before reaching the final memory which holds the information that Abstergo is seeking.
Altaïr is first shown attempting to retrieve one of a series of artifacts known as the "Pieces of Eden" from Solomon's Temple with the help of Malik Al-Sayf, and his brother Kadar, but they are stopped by Robert de Sablé, Grand Master of the Knights Templar and sworn enemy of the Assassins. While retrieving the treasure, Altaïr breaks all three tenets of the Assassins' Creed in an attempt to kill Robert, but he ultimately fails. In the following commotion, Malik's brother is killed, and Malik's left arm is crippled and later amputated. When Altaïr returns to the Assassins' stronghold at Masyaf with apologies, Malik, who survived de Sablé, comes back with the artifact and disparages Altaïr because of his arrogance.
After narrowly defeating a retaliatory attack by the Templars, Al Mualim, leader of the Assassins, demotes Altaïr to a novice but gives him another chance to rise through the ranks of the Brotherhood. Al Mualim assigns Altaïr the task of assassinating nine key figures across the Holy Land in Jerusalem, Acre and Damascus, aiming to bring peace between the Crusader and Saracen forces. Each target is based on an actual historical figure from the Third Crusade, including Majd Addin, Garnier de Naplouse, Jubair al Hakim, Abu'l Nuqoud, Sibrand, William of Montferrat, and Robert de Sablé.
Altaïr completes each task, learning how each target is connected to Robert and the Templars and how together they aim to end the Crusades and place the Holy Land under their own control. With men on both sides killed, he discovers that Robert's last plot is to attempt to unite the Christian and Muslim forces against their new common enemy, the Assassins themselves. Altaïr defeats de Sablé before Richard the Lionheart, failing to convince the King that an end to the war would be welcome to both sides, but ending Robert's plot. From de Sablé, Altaïr discovers that Al Mualim was himself a member of the Templars and used the Assassin to kill the other members who held the secret to the treasure's power, so that he could selfishly keep the artifact for himself.
Altaïr quickly returns to Masyaf and approaches his master, who reveals the truth to him: the Piece of Eden, which he had recovered through the help of Altaïr directly before his transgression, creates illusions. He denounces religion and other seemingly supernatural events (e.g. the Ten Plagues of Egypt, the parting of the Red Sea, and the presence of the Greek Gods in the Trojan War) as illusions caused by the Piece, and then states his intention to use the artifact to compel mankind into a brainwashed state, and in doing so, bringing an end to all conflict; Altaïr is eventually able to see through the deceptions created by the artifact to kill Al Mualim. When Altaïr recovers the artifact, the Piece of Eden activates, showing a holographic view of the world with numerous locations of other Pieces of Eden marked across the globe.
When the process is complete, Desmond learns that Abstergo is a modern-day front of the Templars, and they are already seeking other artifacts at locations identified in Altaïr's memories. Further, he learns that the modern-day Assassins had tried to rescue him before the memory had completed but had failed. Following this, Desmond was to be killed after an order from a high-ranking Templar, Alan Rikkin, but Lucy Stillman saves him from death and, at one point, tucks her ring finger into her palm, referring to the Assassins' tradition of cutting off the finger.
Though Desmond remains trapped in the Abstergo laboratory, his experience in the Animus has created a Bleeding Effect of Altaïr's life in his own, allowing Desmond to use Altaïr's Eagle Vision, which, in turn, allows him to see strange messages painted on the walls of his room and the floor of the lab. The messages all deal with various forms of the end of the world from different cultures, including several references to 21 December 2012, the date that Abstergo plans to launch a satellite that will "permanently end the war." It is hinted that this method would be by the same method that Al Mualim hypnotized Masyaf, only on a larger scale. Finally, the game ends with Desmond wondering what the images all mean and who could have drawn them.
